癌细胞论文发表

癌细胞论文发表

编者按

近日，来自爱荷华大学的科学家们再次证实了高剂量维生素C抗癌的安全性。安全性研究为II 临床试验奠定了基础。研究人员计划在II试验中调查是否高剂量的维生素C能够延长接受化疗和放疗的患者的总体寿命和生活质量。

     3月30日，Cancer Cell杂志上发表了一篇题为“O2⋅− and H2O2-Mediated Disruption of Fe Metabolism Causes the Differential Susceptibility of NSCLC and GBM Cancer Cells to Pharmacological Ascorbate”论文。

        来自爱荷华大学的科学家们通过临床试验发现，作为一种有望改善标准癌症治疗疗效的潜在策略，定期向脑癌和肺癌患者注入800-1000倍的维生素C每日推荐剂量被证明是安全的。同时，研究表明，高剂量的维生素C之所以能够增加癌细胞死亡敏感性与能够改变癌细胞铁代谢的关键通路有关。

人体试验证实，高剂量维生素C抗癌是安全的

        参与脑癌安全性试验的11名患者接受了为期9个月的维生素C注射，前2个月每周注射3次，后7个月每周注射2次，同时他们在接受标准的放疗和化疗。每次注射的目标是提高患者血液中维生素C的浓度到20,000 μM。相比来说，大多数成年人血液中维生素C的浓度约为70 μM。之所以需要很高的剂量，是因为维生素C在人类循环中的半衰期约为2小时。结果显示，治疗通常耐受良好，会产生适度的副作用，包括频繁地去厕所和口干。

1为何是安全的？

         那么，为什么注射高剂量维生素C是安全的？即便在如此高的水平，维生素C也不“伤害”正常细胞。研究小组发现，肿瘤组织中氧化还原活性铁分子（异常线粒体代谢的副产物）的水平异常高，它们会与维生素C反应，生成过氧化氢以及衍生自过氧化氢的自由基。这些自由基被认为会选择性地导致癌细胞DNA损伤，从而引起癌细胞死亡以及癌细胞对放疗和化疗的敏感性增加。

       该研究的共同通讯作者Douglas Spitz说：“我们的研究证实，癌细胞中增加的氧化还原活性金属离子解释了为何癌细胞和正常细胞对高剂量维生素C敏感性存在差异。”

Differential susceptibility of normal cells (left) and cancer cells (right) to vtamin C. Credit: Schoenfeld, et al.

2另一篇论文揭示为何高剂量能“奏效”

        研究共同作者Garry Buettner说：“这一研究揭示了癌细胞代谢的脆弱性。这使得我们能够利用现有的氧化还原活性化合物，如维生素C，使得癌细胞对放疗和化疗变得敏感。”

       我注意到，去年年底，Buettner带领的研究小组曾在Redox Biology杂志发表过另一篇解释高剂量维生素C为何能“杀死”癌细胞的论文（题目：Tumor cells have decreased ability tometabolize H2O2: Implications for pharmacological ascorbate in cancer therapy）。

        具体来说，研究发现，维生素C容易分解，产生过氧化氢。后者是活性氧的一种，能够破坏组织和DNA。正常的细胞有多种途径清除过氧化氢，使其保持在非常低的水平，从而避免受到伤害。与正常细胞相比，癌细胞清除有害过氧化氢的能力更弱。

        研究还证实，过氧化氢酶在这一过程中发挥了关键的作用。当接触高浓度的维生素C时，过氧化氢酶活性低的细胞更容易受到损伤，甚至死亡。Buettner表示，这一发现可能会帮助决定在治疗中联合高剂量维生素C能够改善哪种癌症的治疗以及哪些疗法的效果。

       “我们的研究表明，过氧化氢酶水平较低的癌症可能对高剂量维生素C疗法的响应最大。反之亦然。”他解释道。研究小组的下一目标是，开发测定肿瘤过氧化氢酶水平的方法。

3强调注射，而非口服

        在上述两项研究中，补充维生素C的途径都是注射而非口服。研究证实，静脉注射维生素C——绕过正常的肠道代谢和排泄途径——产生的血药浓度比口服给药产生的浓度要高100-500倍。重要的是，血液中这种“超高”的浓度正是维生素C攻击癌细胞能力的关键。

4结果“喜人”，但结论需谨慎

         安全性研究为II 临床试验奠定了基础。研究人员计划在II试验中调查是否高剂量的维生素C能够延长接受化疗和放疗的患者的总体寿命和生活质量。研究人员目前正在招募4期肺癌患者，并且很快将招募脑癌（多形性成胶质细胞瘤）患者。

        他们希望，在II临床试验中，联合维生素C治疗，脑癌患者对放疗和化疗的响应能够增强。这一预期是基于I试验的数据：11名多形性成胶质细胞瘤患者的总生存期增加了4-6个月。

       该研究的共同通讯作者Bryan Allen表示，尽管现在结果看起来是喜人的，但是在我们完成这些II期试验之前，我们不能确定是否补充高剂量的维生素C能够改善治疗响应。

参考资料：High doses of vitamin C to improve cancer treatment passes human safety trial

求胃癌细胞的western blot步骤，可以直接写在小论文上发表的简洁版

一.实验步骤

1. 组织块称重

2. 利用液氮、研钵粉碎组织块

3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃

4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟

5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟

6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存

7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度

8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液

9. 沸水浴中3分钟

10. 上样

11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）

12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）

13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色

14. Westernblot 试剂盒显色

15. 分析比较记录

western blot的实验步骤及注意事项的资料

1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。

3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。

4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。

5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。

6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。

7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。

8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）
9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。

10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。

11．按步骤9洗涤。

12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。
注意事项：
western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。

Western可以参考如下步骤进行操作。

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。

2. 电泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白.

(3) 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7. 蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

分享一则关于癌症的医学研究报告

癌症研究阶段性成果披露，咖哩, 辣椒,姜等发热的食物让身体蠢蠢欲动的癌细胞多睡觉 。

一场国际研讨会，其中一位目前在美国癌症中心的戴博士以 "Is Cancer Curable? ”(癌症是否能治愈?) 为题，分享了他对癌细胞生长动力学的研究结果。癌症最令人害怕的就是转移-metastasis。 原生癌并不会让病人死亡，而一旦癌细胞转移，在其它组织器官内兴风作浪就让病人逐渐（或快速）的走向死亡。

但为什么有些癌细胞已转移的病人却未继续恶化?

日本医学家曾解剖研究几十位无病痛而自然死亡的 90-103岁老人，发现他们每一位体内都有不少癌细胞。

但为什么他们的癌细胞没有造成身体的病痛?

戴博士和几位癌症研究学者发现，癌细胞在活跃一段时间后会进入 “休眠期”休眠一段时间后又再度活跃兴风作浪。

“休眠期”越长病人能存活的时间就越长，甚至不发生令人害怕的 “转移”。

现在医学界积极的在研究拖延癌细胞“休眠期”的方法，包括利用药物和饮食《有效地预防细胞癌化》那篇论文提到几种天然物，可藉由控制癌细胞内讯息传导 ( signal transduction) 的路径让癌细胞进入“休眠期”请大家多吃含有这些有效成份的食物，让身体内蠢蠢欲动的癌细胞多多睡觉。

1.咖哩(抗癌成份是姜黄素)；

2.辣椒(抗癌成份是辣椒素)；

3.姜(抗癌成份是姜黄素)；

4.绿茶(抗癌成份是儿茶素)；

5.大豆(抗癌成份是异黄酮；

6.蕃茄(抗癌成份是茄红素)；

7.葡萄(抗癌成份是白黎芦醇)；

8.大蒜(抗癌成份是硫化物)；

9.高丽菜(抗癌成份是indole 吲哚)；

10.花椰菜(抗癌成份是硫化物)。

某药剂师加注如下：这篇文章传给大家是做功德，浅显易懂。因为最近医学发表的长寿药物包含以下四种：

姜黄素、白藜芦醇、Silymarin、黄耆（四种成份）前面两样出现在上文中,上文所提到的：

咖哩和姜的抗癌主成分都是“姜黄素”。

卫生管理部门公布大肠癌的主因来自十大恐怖美食，癌症是吃出来的：

1.汉堡薯条+可乐；

2.排骨饭+珍奶；

3.锅贴+豆浆；

4.焗烤意大利面+酥皮浓汤；

5.韩式炸鸡+啤酒；

6.炒饭+贡丸汤；

7.拉面+冰淇淋；

8.卤肉饭+鱼丸汤；

9.红烧牛肉面+酸菜；

10.炸肉圆+关东煮。

中研院努力了8年才完成的排毒最强的食物：

1.地瓜；

2.绿豆；

3.燕麦；

4. 薏仁；

5.小米；

6.糙米；

7.红豆；

8.胡萝卜；

9.山药；

10.牛蒡；

11.芦笋；

12.洋葱；

13. 莲藕；

14.白萝卜；

15.山茼蒿 (裂叶茼蒿) ；

16.地瓜叶；

17.萝卜叶；

18.川七；

19.优格光；

20.醋。

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